一.實驗名稱:細胞的復(fù)蘇

二.實驗?zāi)康?將凍存的細胞恢復(fù)活性

三.實驗原理:在低于-70℃的超低溫條件下,有機體細胞內(nèi)部的生化反應(yīng)其緩慢,甚至終止。所謂冷凍保存,就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中,以一定的冷凍速率降至零下某度(一般是低于-70°c的超低溫條件),并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃,使細胞存時的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶,對細造成損害。

四.實驗步驟

1.實驗前準(zhǔn)備

1).將珠浴器（DHB-200）預(yù)熱至37℃,將培養(yǎng)液預(yù)熱后分裝到培養(yǎng)皿中

2）.離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等

2.取出凍存管

1）.根據(jù)細胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細胞的編號.

2）.從液氫罐中取出細胞盒,取出所需的細胞,同時核對管外的編號

3.迅速解凍

1）.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍,并要不斷的搖動的液體迅速融化

2）.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內(nèi)。

4.平衡離心:用架盤天平平衡后,放入離心機中3000r/min離心3min

五.制備細胞懸液

1）.吸棄上清液

2）.向離心管內(nèi)加入10m培養(yǎng)液,吹打制成細胞懸液

六.細胞計數(shù):細胞濃度以5x105/ml為宜。

七.培養(yǎng)細胞

將復(fù)合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶養(yǎng)瓶放入37℃5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)24小時(或者24-48小時)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng),換液的時間由細胞情況而定。

初學(xué)者易犯錯誤：

1.珠浴器（DHB-200）未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃

2.珠浴器（DHB-200）內(nèi)凍存管太多,導(dǎo)致傳熱不佳,使融化時間延長

3.離心前忘記平衡,導(dǎo)致離心機損壞和細胞丟失。

4.一次復(fù)蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管,導(dǎo)致細胞交叉污染。

版本2

一.細胞復(fù)蘇的原則

在實際操作中,凍存細胞要進行復(fù)蘇,再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結(jié)晶快速融化,以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi),再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞

二.細胞復(fù)蘇的主要操作步驟

(1)佩戴眼鏡和手套,從液氮罐中取出安瓿或冷凍管

(2)迅速放入38℃恒溫珠浴器（DHB-200）中,并不時搖動,在1分鐘內(nèi)使其完全融化,然后在無菌下取出細胞

(3)在1000r/min速度下離心5~10分鐘,棄去上層液,加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中,接種濃度1×10°幾L,置37℃溫箱靜置培養(yǎng),次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),觀察生長情況。若細胞密度較高,及時傳代?；驘o需離心直接將細胞加入瓶中,并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12~24小時后,充去上清,換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

三.注意事項

在細胞復(fù)蘇操作時,應(yīng)注意融化凍存細胞速度要快,可不時搖動安瓿或冷凍,使之盡快通過最易受損的溫度段(-5~0℃)。這樣復(fù)蘇的凍存細胞存活率高,生長及形態(tài)良好。然而,由于凍存的細胞還受其他因素的影響,有時也會有部分細胞死亡。此時,可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上(已死亡)的細胞輕輕倒掉,再補以適量的新培養(yǎng)液,也會獲得較為滿意的結(jié)果。